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WIRKSAMKEIT: Unbedenklichkeit

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II. UNBEDENKLICHKEIT

In therapeutischer Dosis hat das Produkt keine schädlichen Nebenwirkungen, es schädigt keine blutbildenden Organe oder andere rasch proliferierende Gewebe und greift nur bösartige Zellen an. Wegen seines sehr hohen therapeutischen Index von 1250 im Gegensatz zu allgemeinen Zytostatika, welche einen therapeutischen Index von 1,4 - 1,8 haben, besteht keine Gefahr einer Überdosierung bei der NSC 631570 Therapie. (Therapeutischer Index ist ein Maß der relativen Sicherheit eines Arzneimittels, ausgedrückt als das Verhältnis der tödlichen oder toxischen Dosis zu der therapeutisch wirksamen Dosis. Aus dem „Kurzen Glossar chemischer und biochemischer Begriffe“, Europäische Beobachtungsstelle für Drogen und Drogensucht, http://www.emcdda.europa.eu/publications/drug-profiles/glossary/de). Dank des sehr hohen therapeutischen Index verursacht NSC 631570 keine Nekrosen bei intramuskulärer Verabreichung, was in der Phase I Studie an gesunden Probanden bewiesen wurde (37).

Österreichisches Forschungszentrum Seibersdorf ist die führende österreichische Forschungseinrichtung im Bereich Lebenswissenschaften und ist jetzt ein Teil des Austrian Institut of Technology (kurz: AIT) - der größten außeruniversitären Forschungseinrichtung in Österreich.
In Seibersdorf werden die toxikologischen Untersuchungen nach dem aktuellen Stand der Wissenschaft und entsprechend der GLP-Richtlinien (Gute Laborpraxis) durchgeführt. Folgende GLP-konforme Studien mit NSC 631570 wurden in ARCS durchgeführt.

Akute Intravenöse Toxizität mit Ratten

Die Studie wurde im Einklang mit der EC-Richtlinie 92/69 und der OECD-Richtlinie 401 durchgeführt. Die Testsubstanz wurde unverdünnt als langsame intravenöse Injektion männlichen und weiblichen Ratten Him:OFA in der Dosierungen 33 mg/kg, 57 mg/kg oder 100 mg/kg (nur Weibchen) Körpergewicht (KG) verabreicht. Die Verabreichung hat unmittelbare Wirkungen verursacht, welche, wenn nicht letal, führten zur fast kompletten Genesung. Die wahrscheinlichste Todesursache war eine pH- oder Ionenverschiebung im Blut. Männchen waren mehr anfällig als Weibchen. Basierend auf den Ergebnissen dieser Studie, die LD50 (intravenös) von NSC 631570 war als 43 mg/kg KG für Männchen und 76 mg/kg KG für Weibchen ermittelt (151, OEFZS-A-4483, Oktober 1998).

Akute Intravenöse Toxizität mit Mäusen

Die Studie wurde im Einklang mit der Direktive 92/69/EEC und der OECD-Richtlinie 401, 1987 durchgeführt. NSC 631570 wurde mittels langsamer intravenöser Injektion drei Gruppen von 5 männlichen und 5 weiblichen Him:OF1 SPF Mäusen in der Dosierungen 33 mg/kg, 74 mg/kg und 165 mg/kg KG verabreicht. Alle Tiere in der Hochdosisgruppe sowie 2 Männchen und 3 Weibchen in der mittleren Dosisgruppe sind gestorben. Alle anderen Tiere überlebten bis 14 Tage nach der Verabreichung und waren normal am Ende der Studie. Alle Tiere waren normal bei der pathologischen Untersuchung. Es hat keinen merklichen Geschlechtsunterschied in der Reaktion auf die Testsubstanz gegeben. Basierend auf den Ergebnissen der Studie wurde die LD50 (intravenös) als 80 mg/kg KG für Männchen und 68 mg/kg KG für Weibchen berechnet (OEFZS-L-0400, Mai 2000).

Akute intramuskuläre Toxizität mit Ratten

Das Ziel dieser Studie war die toxischen Wirkungen von NSC 631570 nach einer einmaligen intramuskulären Verabreichung an Ratten zu untersuchen. Die Studie wurde im Einklang mit der EC-Direktive 87/176/EWG sowie der OECD-Richtlinie 401, soweit diese für die intramuskuläre Verabreichung von Bedeutung waren, durchgeführt. Die Testsubstanz war unverdünnt als intramuskuläre Injektion an 5 männliche und 5 weibliche Him:OFA Ratten in der technisch höchst möglichen Dosis für die geplante Verabreichungsweise, d.h. 150 mg Aktivsubstanz pro kg KG. Alle Tiere überlebten bis zum vorgesehenen Endzeitpunkt der Studie. Die Körpergewichtszunahme war nicht beeinträchtigt. Sedierung und mehr ausgeprägte gestörte Lokomotorik war am Tag der Verabreichung bemerkbar. Lokale Änderungen an der Injektionsstelle (Krusten) waren bei etwa der Hälfte aller Tiere vorhanden. Es gab keinen Geschlechtsunterschied in der Reaktion auf die Testsubstanz. Die Autoren kommen zur Schlussfolgerung, dass die intramuskuläre Injektion von NSC 631570 in der technisch höchst möglichen Dosis einige vorübergehende Symptome von unwesentlicher klinischer Bedeutung bewirkt hat, ansonsten aber gut toleriert wurde und nicht lebensgefährlich war. Basierend auf den Ergebnissen dieser Studie war die LD50 (intramuskulär) von NSC 631570 als > 150 mg/kg KG berechnet (151, OEFZS-L-0194, Oktober 1999).

Akute orale Toxizitätsstudie mit Ratten

Das Ziel der Studie war es, die toxischen Wirkungen von NSC 631570 nach der einmaligen oralen Verabreichung an Ratten zu untersuchen. Die Studie wurde entsprechend der EC-Direktive 92/69 und der OECD-Richtlinie 401 durchgeführt. NSC 631570 Konzentrat war unverdünnt einmalig mittels Magenintubation an 3 Gruppen von 5 weiblichen Him:OFA Sprague Dawley Ratten und an 1 Gruppe männlicher Sprague Dawley Ratten in den Dosierungen 450 mg/kg KG, 810 mg/kg KG und 1500 mg/kg KG (Weibchen) sowie nur 810 mg/kg KG (Männchen) verabreicht. Alle Weibchen in der höchsten Dosierungsgruppe verstarben am Tag der Verabreichung. Alle Weibchen in beiden anderen Dosierungsgruppen sowie alle Männchen überlebten bis zum vorgesehenen Studienbeendigung. Alle Tiere der mittleren und der hohen Dosierungsgruppen waren mit den meisten Symptomen am Tag der Verabreichung der Testsubstanz beeinträchtigt. Die Wirkungen haben maximal 3 Tage nach der Verabreichung gedauert. Alle überlebten Tiere waren normal am Ende der Studie. Es gab keinen Geschlechtsunterschied in der Reaktion auf die Testsubstanz.
Fazit: die Testsubstanz hat sofortige Folgen hervorgerufen, welche, wenn nicht letal, bald zu einer fast kompletten Genesung führten. Die LD50 (oral, Webchen) was als 1110 mg/kg KG berechnet (151, OEFZS-L-0195, October 1999).

Lokale Verträglichkeit

NSC 631570 wurde als langsame intravenöse, intraarterielle, paravenöse oder intramuskuläre Injektion an je 2 männliche und 2 weibliche Kaninchen per Verabreichungsweg gegeben. Isotonische Kochsalzlösung wurde entsprechend ins andere Ohr oder den Muskel jeden Tiers als Kontrolle injiziert. NSC 631570 wurde als intravenöse oder intraarterielle Injektion gut vertragen. Die paravenöse Verabreichung hat eine milde lokale Reizung verursacht, und die intramuskuläre Injektion hat eine milde bis moderate Entzündung hervorgerufen. Es gab keinen Geschlechtsunterschied in der Reaktion auf die Testsubstanz (OEFZS-A-4204, Oktober 1997).

Mikronukleustest mit Mäusen

Die Studie wurde durchgeführt, um eine mögliche Bildung von Mikronuklei infolge der Wirkung von NSC 631570 als Folge der chromosomalen Beschädigung an dem mitotischen Apparats in einem System in vivo. NSC 631570 wurde mit der isotonischen Kochsalzlösung verdünnt und einmalig in der Dosis 1,25, 2,50 oder 5,00 ml/kg KG intravenös an drei Gruppen von je 5 männlichen und 5 weiblichen Mäusen Crl:NMRI BR verabreicht. Zusätzlich wurde eine Hochdosisgruppe (ein Männchen und ein Weibchen) als Reserve in die Studie aufgenommen, um die möglicherweise ungeplant verstorbene Tiere in der Hochdosisgruppe zu ersetzen. Zwei negative Kontrollgruppen (isotonische Kochsalzlösung) und eine positive Kontrollgruppe (Thiotepa) wurden auch in die Studie aufgenommen. Die Aufbereitung der Knochenmarkzellen und deren Untersuchungen wurden entsprechend der OECD-Richtlinie 474 durchgeführt.
Alle Tiere haben bis zur vorgesehenen Opferung überlebt. Thiotepa (positive Kontrollgruppe) bewirkte Zytotoxizität und Mikronukleibildung in den polychromatischen Erythrozyten. NSC 631570 hat keine zytotoxische Wirkungen ausgeübt, alle Daten waren im Bereich der historischen negativen Kontrolldaten. Es gab keine signifikanten Unterschiede in normochromen Mikronukleus-Erythrozyten (NME) zwischen den Tieren beider Geschlechter in Testguppen und entsprechenden negativen Kontrollgruppen, sowohl nach 24, als auch 38 Stunden nach der Verabreichung. Ebenso keinen statistisch signifikanten Unterschied in den Anzahl der polychromatischen Mikronukleus-Erythrozyten (PME) gab es in allen Gruppen bei allen Dosierungen. Die Raten von PME waren zu beiden Probenahmezeitpunkten im Referenzbereich der historischen negativen Kontrollgruppen. Es wurde kein Geschlechtsunterschied im Ansprechen auf die Testsubstanz festgestellt. Die Autoren kommen zum Schluss, dass NSC 631570 in der Dosierung bis zu 5 mg/kg KG keine Zytotoxizität gegenüber Knochenmark ausübt und keine Mikronuklei in den polychromatischen Mikronukleus-Erythrozyten in Mäusen beider Geschlechter in den verwendeten Dosierungen produziert (OEFZS-L-0225, November 1999).

Salmonella typhimurium Reverse Mutation Test

NSC 631570 wurde im Salmonella typhimurium Reverse Mutation Test(Ames-Test) auf mutagene Aktivität gemäß der Richtlinie OECD 471 und EEC 92/69 Teil B14 geprüft. Die Testsubstanz wurde in einem Breiten Konzentrationsbereich entsprechend der direkten Plattenaufnahme-Methode mit und ohne externe Metabolisierungssystem S9-mix. Die Bakterienstämme S. typhimurium TA97a, TA98, TA100, and TA1535 wurden als Testsystem verwendet. Negative sowie positive Kontrollgruppen wurden einbezogen und eine unabhängige Wiederholung des Experiments wurde durchgeführt. Die Testsubstanz war nicht toxisch gegenüber den eingesetzten Bakterienstämmen. Den Ergebnissen der Studie zufolge NSC 631570 ist nicht mutagen im Ames-Test mit den Stämmen TA97a, TA98, TA100, TA102, and TA1535 (OEFZS-L-0003, Januar 1999).

Lebertoxizität

Da die Ausgangsstoffe für die Herstellung von NSC 631570 – Schöllkrautalkaloide und Thiotepa toxisch für die Leberzellen sind, wurde eine Studie zur Untersuchung der möglichen toxischen Wirkungen von NSC 631570 auf die Leber veranlasst. Die Studie wurde in Ratten durchgeführt und hat bestätigt, dass NSC 631570 die Leber nicht schädigt (Müller 2004, Originalbericht).

Andere Toxizitätsstudien

Viele andere Toxizitätsstudien wurden mit NSC 631570 in Osteuropa durchgeführt (15, 16, 105, 123, 127).
Die ersten toxikologischen Untersuchungen wurden an Mäusen Albino Swiss sowie Ratten Wistar durchgeführt. NSC 631570 wurde intraperitoneal in der Dosierung 0,025, 0,05 und 0,1 von LD50 (d.h. 4,75, 9,5 und 19 mg/kg bei Mäusen und 7, 14 und 28 mg/kg bei Ratten) einmal täglich während 3 Monaten verabreicht. Die Behandlung hat die Gewichtszunahme bei Tieren in allen Dosierungsgruppen nicht beeinflusst. Die Lokomotorik wurde in den Gruppen mit niedriger Dosierung nicht verändert. In Ratten wurde die spontane lokomotore Aktivität in den die Dosierungsgruppen 14 und 28 mg/kg sowie in Mäusen in den Dosierungsgruppen 9,5 und 19 mg/kg unterdrückt.
Die Behandlung hat keinen Einfluss auf das Organengewicht ausgeübt mit Ausnahme von Milz bei Ratten, wo das Gewicht bis zu 3mal höher war als in der Kontrollgruppe (29). Bei den Untersuchungen der Katecholaminen im Hirn wurde festgestellt, dass im Vergleich zu den Kontrollgruppen die 3monatige Behandlung mit NSC 631570 in mittlerer und höherer Dosierung die Dopaminkonzetration sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten verringerte. Die Konzentrationen von Noradrenalin, 5-Hydroxytryptamin und 5-Hydroxyindolacetat sind unverändert geblieben (29). Die einmalige Verabreichung hat keinen Einfluss auf die Prolaktinkonzentration in Serum von Ratten. Hingegen war die Serumkonzentration von Prolaktin bei der 3monatigen Verabreichung von NSC 631570 in allen Dosierungsgruppen erhöht im Vergleich zur Kontrollgruppe (32).

In männlichen sowie weiblichen Ratten und Mäusen hat die Behandlung mit der mittleren und höchsten Dosierung ähnliche Änderungen bewirkt: die Steigerung der Leukozytenzahl und die Abnahme der Trombozytenzahl. Die Änderungen des Leukogramms wurden ebenso beobachtet, nämlich Steigerung der Lymphozyten und Abnahme der segmentkernigen Neutrophilen. Keine signifikanten Änderungen in den Rotblutwerten wurden im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet (33).

Keine Änderungen wurden auch in der Transaminasenaktivität bei Ratten beobachtet. In Mäusen, Steigerung der ALT- und AST-Aktivität ist in den Gruppen mit mittleren und höchsten Dosierung eingetreten. Eine leichte Abnahme des Gesamtproteinwerts wurde bei männlichen Mäusen in den Gruppen 9,5 und 19,5 mg/kg beobachtet, bei weiblichen Mäusen – nur in der 19 mg/kg Gruppe. Die einmalige Verabreichung der Testsubstanz hat keine Änderungen der untersuchten Parameter bewirkt (31).

In den Untersuchungen an Hamsterzellen wurde festgestellt, dass NSC 631570 nicht mutagen sowie nicht genotoxisch wirkt und keine morphologischen Zelltransformationen auslöst (19).

In den Versuchen an Mäusen und Meerschweinchen wurde bewiesen, dass NSC 631570 keine anaphylaktische Sensibilisierung auslöst (23).

In Ratten hat NSC 631570 keine embryotoxische oder teratogene Wirkung ausgeübt. In Hamstern wurde die embryotoxische Wirkung bei der sehr hohen Dosierung von 28 mg/kg KG beobachtet (30).

In einer Reihe von Experimenten wurde die Wirkung von NSC 631570 bei der 6-wöchigen Gabe an Kaninchen untersucht (so genannte subakute Toxizität).
Die tägliche Behandlung in drei verschiedenen Dosierungen hat keine Auswirkungen auf die Organenmorphologie und Körpergewicht der Tiere verursacht. Im Blutbild hat sich die Anzahl von roten sowie weißen Blutkörperchen nicht geändert. In der hoch dosierten Gruppe sind die Prozentanteile der Lymphozyten, Monozyten und Eosinophilen gestiegen. Die chemischen Parameter wurden nicht beeinflusst mit der Ausnahme vom Anstieg des Harnstoffs und der Harnsäure (124).

Unter Geschlechtshormonen, Estradiol ist in einigen Gruppen gestiegen und Testosteron ist in Männchen der Gruppe mit niedrigsten Dosierung gestiegen. In Weibchen wurde der Anstieg von Progesteron nur in der Gruppe mit höchster Dosierung beobachtet (125).

NSC 631570 verursachte den Anstieg von Schilddrüsenhormonen bei Männchen. Bei Weibchen ist nur Triiodthyronin gestiegen und Thyroxinspiegel blieb unverändert (126).

In einer Studie an männlichen Ratten Wistar haben die Forscher festgestellt, dass die 6-tagige Verabreichung in beiden Dosierungen 1 mg/kg und 2 mg/kg keine signifikanten Veränderungen in folgenden Parameter bewirkte: Albumin, Mucopolysaccharide, Aktivität der Aminotransferasen, Thymoltest. Ebenfalls unbeeinflusst im Vergleich zur Kontrollgruppe war die Morphologie des Lebergewebes. Signifikant niedriger war die Blutkonzentration von mittleren Molekülen (216).

In der Arbeit an Ratten Wistar mit implantiertem wurde herausgefunden, dass NSC 631570 die Anzahl von Thiolgruppen in den Tumorhomogenaten reduzierte (121).

PHARMAKOKINETIK

Um den Plasmaspiegel und die pharmakokinetische Parameter von NSC 631570 bei intravenöser Verabreichung zu bestimmen, wurde zuerst die Methode für seine Bestimmung im Plasma entwickelt (152).

Dies ermöglichte in weiterer Folge eine Studie der Pharmakokinetik von NSC 631570 in Ratten. Es zeigte sich, dass das Tumorgewebe und die Leber die stärkste Affinität für NSC 631570 hatten. Im Gehirn- und Muskelgewebe hat sich das Präparat am wenigsten akkumuliert (153).

BIOPHYSIKALISCHE EIGENSCHAFTEN

Die Untersuchungen mit physischen Methoden (Spektrometrie, Mikroskopie in polarisierendem Licht) haben ergeben, dass NSC 631570 resistent gegen die Einwirkung vom UV-Licht mittlerer Intensität ist. Die Absorptionspeaks 210 und 230 nm können zum Nachweis des Präparates im Plasma verwendet werden (50, 81).

In den Untersuchungen an Rattenleberhomogenaten wurde der Sauerstoffverbrauch mittels Polarographie gemessen. Die Zugabe von NSC 631570 bewirkte komplexe Redoxreaktionen im Substrat, was von der NADP-induzierten Oxidation abhängig war (82).